Dr. Thomas Reinard, Eva-Maria Plönnigs, Yahui Huang, Shannon McCallan, Michael Werner
Leibniz Universität Hannover, Institut für Pflanzengenetik Abt. II, AG Molekulare Biochemie
Die Arbeitsgruppe von Dr. Reinard produziert die für das Projekt benötigten Allergene Ara h 1 (Erdnuss) und Bra j 1 (Senf) in der Wasserlinse Wolffia australiana, denn in E. coli kann Bra j 1 gar nicht und Ara h 1 nur als Teilprotein ohne Glykosylierung (das sog. Core-Protein) exprimiert werden.
Die Wasserlinse Wolffia australiana als Bioreaktor
Die Wasserlinse Wolffia australiana, ist – trotz ihres reduzierten Körperbaus – nicht nur die kleinste Blütenpflanze der Welt, sondern auch eine besonders hoch entwickelte Blütenpflanze. Sie ist anspruchslos und kann sich extrem schnell vegetativ vermehren (bei einer Verdoppelungsrate von ca. 40 Stunden). Ein weiterer Vorteil dieser von uns auch Genom- und Transkriptom-sequenzierten Pflanze liegt darin, dass sie auf kleinsten Raum viel proteinreiche Biomasse produziert, sowohl in Flüssigkultur (untergetaucht und an der Wasseroberfläche) als auch auf Agarplatten.
Epitop-Kartierung mittels Ara h 1-basierten Mosaikproteinen
Bioinformatische Analysen resultierten in einigen Ungereimtheiten bei den in den 90er Jahren durchgeführten Epitopkartierungen von Ara h 1. Dies liegt möglicherweise daran, dass diese Experimente mittels kleiner Peptide durchgeführt wurden, die zwar ganz gut die linearen Epitope von Lebensmittelallergenen repräsentieren, allerdings deren strukturellen Kontext im Protein unbeachtet lassen.
Daher haben wir ein modulares Klonierungssystem (LAMA) entwickelt, welches auf der Golden Gate Klonierung, bzw. dem MoClo-System beruht und den schnellen und effizienten Austausch eines einzelnen Epitops oder einer Gruppe an aufeinanderfolgenden Epitopen erlaubt. Dabei werden die Bereiche der allergenen Erdnuss durch die entsprechenden Regionen des Homologs Phaseolin aus der nicht-allergenen Gartenbohne ersetzt. Die so entstehenden Mosaikproteine können anschließend in ihrer strukturellen Protein-Konformation mit Patientenseren auf reduzierte Allergenität hin getestet werden. Dazu wird LAMA mit dem oben beschriebenen Replikon-basierten Wolffia Bioreaktor kombiniert, der die Produltion des glykosylierten Volllängenproteins erlaubt.
LAMA kann als Blaupause für eine wesentlich zuverlässigere Epitopkartierung für jedes andere Nahrungsmittelallergen angesehen werden.